TRANSFORMACIÓN EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS:
Los sistemas de estas bacterias Gram positivas son inespecíficos respecto de la captación de ADN exógeno: no distinguen entre ADN homólogo (de la misma especie) o ADN heterólogo (de otras especies). Sin embargo, aunque físicamente puede entrar ADN heterólogo, éste se recombina posteriormente con el endogenote sólo en el caso de presentar con él un grado de homología suficientemente alto. Únicamente se recombinan moléculas de ADN de la misma especie (o en algunos casos, de especies muy cercanas).
Veamos comparativamente los procesos de transformación en el neumococo (S. pneumoniae) y en B. subtilis:
EN Streptococcus pneumoniae
Desarrollo de la competencia (y modo de unión del ADN a la superficie celular):
Como dijimos, el estado de competencia se encuentra condicionado por una serie de factores, como densidad celular, temperatura, pH, etc.
- La competencia se desarrolla al final del periodo de crecimiento exponencial (fase logarítmica);
- Afecta prácticamente a la totalidad de las células del cultivo (100% de células competentes).
- Conforme las células van creciendo (se van multiplicando), van sintetizando y excretando al medio un péptido específico (de 5-10 kDa), llamado factor activador de la competencia (FAC). Este factor no ejercerá su efecto hasta que la densidad celular alcance un valor del orden de una 107 células/ml, momento en el que el FAC se habrá acumulado hasta lograr una concentración adecuada para ejercer su función.
- Entonces, el FAC se une a un receptor específico de la superficie celular, lo que provoca (no se sabe cómo) la inducción de la expresión de una serie de genes, que codifican unas 12 proteínas específicas de la transformación, entre las que se cuenta una autolisina.
- Esta autolisina provoca una degradación parcial y controlada de la pared celular, de modo que quedan al descubierto complejos de proteínas que son sitios de unión al ADN exógeno (existen unos 30-80 sitios de unión por cada individuo de neumococo).
- El ADN exógeno libre en el medio se une a estos sitios, que cuentan con una actividad endonucleasa específica de transformación: provoca incisiones en una de las hebras del ADN c.d. El extremo 3' generado queda unido a alguna proteína del complejo receptor.
Las incisiones consecutivas en una misma molécula de ADN exógeno están separadas entre sí por una media de una 6 kb.
Recordemos que el ADN no tiene por qué ser específico: se puede unir ADN de procedencias muy diversas (incluso ADN eucariótico).
Entrada del ADN y fase de eclipse
Esta fase se pone de manifiesto en el laboratorio por el hecho de que el ADN exógeno se convierte a una forma resistente a la DNasa. Esto significa que este ADN ha sido transportado desde el medio externo al interior celular (o al menos a algún "compartimento" donde se ve protegido del ataque de la nucleasa). Este paso del proceso de transformación depende de:
- cationes divalentes (Mg++, Ca++), o monovalentes (K+);
- una endonucleasa situada a nivel de membrana (endonucleasa-I), que degrada la cadena que previamente (en la fase 1ª) había permanecido intacta.
En S. pneumoniae:
- La endonucleasa-I de membrana rompe la cadena que previamente había quedado intacta, y a partir del sitio de corte va degradando esta cadena no unida al complejo receptor (liberando oligonucleótidos de 1 a 10 bases de longitud). Simultánea y concomitantemente con esta acción, la otra cadena (la que antes se había unido al receptor) va pasando al citoplasma, comenzando por su extremo 3', y progresando hacia su extremo 5', a expensas precisamente de la energía derivada de la hidrólisis de la cadena opuesta.
- Conforme va entrando, esta cadena va siendo recubierta por monómeros (de unos 20 kDa) de una proteína específica, hasta formarse el complejo de eclipse (entre ese ADN de c.s. y las proteínas). Dicho complejo cumple dos funciones:
protege al exogenote del ataque de las nucleasas citoplásmicas;
prepara al exogenote para la ulterior fase de recombinación.
- Si utilizáramos este ADN de c.s. del complejo de eclipse para intentar una nueva transformación, no podría ser reconocido por el complejo receptor que describimos anteriormente. Esta es la razón de la existencia de lo que hemos denominado período de eclipse.
Destino del ADN del exogenote
Recombinación de la cadena sencilla del exogenote con la zona complementaria del endogenote, previo desplazamiento y ulterior degradación de la cadena homóloga de éste. Esta recombinación homóloga es muy eficiente (un 50% del ADN transportado se integra).
- Como resultado de esta integración se forma un heterodúplex.
- Si el heterodúplex posee malos emparejamientos de bases (debido a que la secuencia del exogenote no es idéntica a la del endogenote), pueden ocurrir dos alternativas, dependiendo de si estos malos emparejamientos logran o no ser reparados antes del siguiente ciclo de replicación del genóforo:
1. si son reparados antes de la replicación se puede perder el marcador portado por el endogenote, que se ve sustituido por el del exogenote;
2. si el heterodúplex no se repara en el siguiente ciclo replicativo cada cadena servirá de molde para una nueva doble hélice, pasando cada una a una célula hija. De este modo, a partir de este evento de recombinación surge una progenie mixta: existe un subclon recombinate y otro que no lo es.
Es de destacar que, además, S. pneumoniae posee un sistema muy refinado para facilitar esta recombinación en los fenómenos de transformación:
- existe un gen (hex) que codifica una proteína que se une a varios lugares concretos del genomio hospedador, e interviene en la corrección de las bases mal emparejadas. Si el exogenote se integra lejos de uno de los sitios reconocidos por Hex, no se ve reparado por dicho sistema, el heterodúplex "escapa" a la corrección, y por lo tanto toda la progenie heredará el marcador nuevo procedente del exogenote.
Los sistemas de estas bacterias Gram positivas son inespecíficos respecto de la captación de ADN exógeno: no distinguen entre ADN homólogo (de la misma especie) o ADN heterólogo (de otras especies). Sin embargo, aunque físicamente puede entrar ADN heterólogo, éste se recombina posteriormente con el endogenote sólo en el caso de presentar con él un grado de homología suficientemente alto. Únicamente se recombinan moléculas de ADN de la misma especie (o en algunos casos, de especies muy cercanas).
Veamos comparativamente los procesos de transformación en el neumococo (S. pneumoniae) y en B. subtilis:
EN Streptococcus pneumoniae
Desarrollo de la competencia (y modo de unión del ADN a la superficie celular):
Como dijimos, el estado de competencia se encuentra condicionado por una serie de factores, como densidad celular, temperatura, pH, etc.
- La competencia se desarrolla al final del periodo de crecimiento exponencial (fase logarítmica);
- Afecta prácticamente a la totalidad de las células del cultivo (100% de células competentes).
- Conforme las células van creciendo (se van multiplicando), van sintetizando y excretando al medio un péptido específico (de 5-10 kDa), llamado factor activador de la competencia (FAC). Este factor no ejercerá su efecto hasta que la densidad celular alcance un valor del orden de una 107 células/ml, momento en el que el FAC se habrá acumulado hasta lograr una concentración adecuada para ejercer su función.
- Entonces, el FAC se une a un receptor específico de la superficie celular, lo que provoca (no se sabe cómo) la inducción de la expresión de una serie de genes, que codifican unas 12 proteínas específicas de la transformación, entre las que se cuenta una autolisina.
- Esta autolisina provoca una degradación parcial y controlada de la pared celular, de modo que quedan al descubierto complejos de proteínas que son sitios de unión al ADN exógeno (existen unos 30-80 sitios de unión por cada individuo de neumococo).
- El ADN exógeno libre en el medio se une a estos sitios, que cuentan con una actividad endonucleasa específica de transformación: provoca incisiones en una de las hebras del ADN c.d. El extremo 3' generado queda unido a alguna proteína del complejo receptor.
Las incisiones consecutivas en una misma molécula de ADN exógeno están separadas entre sí por una media de una 6 kb.
Recordemos que el ADN no tiene por qué ser específico: se puede unir ADN de procedencias muy diversas (incluso ADN eucariótico).
Entrada del ADN y fase de eclipse
Esta fase se pone de manifiesto en el laboratorio por el hecho de que el ADN exógeno se convierte a una forma resistente a la DNasa. Esto significa que este ADN ha sido transportado desde el medio externo al interior celular (o al menos a algún "compartimento" donde se ve protegido del ataque de la nucleasa). Este paso del proceso de transformación depende de:
- cationes divalentes (Mg++, Ca++), o monovalentes (K+);
- una endonucleasa situada a nivel de membrana (endonucleasa-I), que degrada la cadena que previamente (en la fase 1ª) había permanecido intacta.
En S. pneumoniae:
- La endonucleasa-I de membrana rompe la cadena que previamente había quedado intacta, y a partir del sitio de corte va degradando esta cadena no unida al complejo receptor (liberando oligonucleótidos de 1 a 10 bases de longitud). Simultánea y concomitantemente con esta acción, la otra cadena (la que antes se había unido al receptor) va pasando al citoplasma, comenzando por su extremo 3', y progresando hacia su extremo 5', a expensas precisamente de la energía derivada de la hidrólisis de la cadena opuesta.
- Conforme va entrando, esta cadena va siendo recubierta por monómeros (de unos 20 kDa) de una proteína específica, hasta formarse el complejo de eclipse (entre ese ADN de c.s. y las proteínas). Dicho complejo cumple dos funciones:
protege al exogenote del ataque de las nucleasas citoplásmicas;
prepara al exogenote para la ulterior fase de recombinación.
- Si utilizáramos este ADN de c.s. del complejo de eclipse para intentar una nueva transformación, no podría ser reconocido por el complejo receptor que describimos anteriormente. Esta es la razón de la existencia de lo que hemos denominado período de eclipse.
Destino del ADN del exogenote
Recombinación de la cadena sencilla del exogenote con la zona complementaria del endogenote, previo desplazamiento y ulterior degradación de la cadena homóloga de éste. Esta recombinación homóloga es muy eficiente (un 50% del ADN transportado se integra).
- Como resultado de esta integración se forma un heterodúplex.
- Si el heterodúplex posee malos emparejamientos de bases (debido a que la secuencia del exogenote no es idéntica a la del endogenote), pueden ocurrir dos alternativas, dependiendo de si estos malos emparejamientos logran o no ser reparados antes del siguiente ciclo de replicación del genóforo:
1. si son reparados antes de la replicación se puede perder el marcador portado por el endogenote, que se ve sustituido por el del exogenote;
2. si el heterodúplex no se repara en el siguiente ciclo replicativo cada cadena servirá de molde para una nueva doble hélice, pasando cada una a una célula hija. De este modo, a partir de este evento de recombinación surge una progenie mixta: existe un subclon recombinate y otro que no lo es.
Es de destacar que, además, S. pneumoniae posee un sistema muy refinado para facilitar esta recombinación en los fenómenos de transformación:
- existe un gen (hex) que codifica una proteína que se une a varios lugares concretos del genomio hospedador, e interviene en la corrección de las bases mal emparejadas. Si el exogenote se integra lejos de uno de los sitios reconocidos por Hex, no se ve reparado por dicho sistema, el heterodúplex "escapa" a la corrección, y por lo tanto toda la progenie heredará el marcador nuevo procedente del exogenote.
